重磅上市 | 百英生物CHOK1-FUT8去岩藻糖抗体表达平台
百英生物重磅上线CHOK1-Fut8KO 去岩藻糖抗体表达平台，结合百英的高通量重组抗体表达平台的细胞培养工艺，可快速实现去岩藻糖抗体生产。
2023年7月，创胜集团研发的Osemitamab(TST001)宣布已获得CDE和MFDS批准，将在HER2阴性、CLDN18.2表达的一线局部晚期或转移性胃或胃食管(G/GEJ)结合部腺癌患者中开展联合纳武利尤单抗与化疗的TranStar 301全球III期关键性临床试验。Osemitamab是一种第二代靶向CLDN18.2 的人源化抗体，具有增强的ADCC作用，通过ADCC机制杀死表达CLDN18.2的肿瘤细胞。研究人员在Osemitamab的生产过程中，通过技术改造降低了Osemitamab的岩藻糖含量，增强了Osemitamab的NK细胞介导的ADCC活性。
01
治疗型抗体的作用机制
目前在肿瘤治疗中被批准广泛使用的单克隆抗体药物主要是IgG1亚型，抗体发挥作用的核心是ADCC效应。IgG1的恒定区（Fc）通过结合细胞表面Fc受体（FcγRIIIa）来发挥抗体依赖的细胞介导的的细胞毒作用（ADCC）、补体介导的细胞毒作用（CDC）和凋亡（apoptosis）来攻杀癌细胞[1]。
图1 抗体发挥作用的方式
02
岩藻糖修饰与抗体ADCC效应的关联
根据单克隆抗体的作用机制，其糖基化的位点、糖型种类及丰度都可能影响产品的有效性、安全性和质量稳定性，单抗Fc段的糖基化水平可直接影响ADCC和CDC杀癌细胞效率。
ADCC由Fc与 Fc-γ 受体（FcγR）结合后引发，其结合力明显受CH2结构域中 N-聚糖影响，而研究表明降低/去除核心糖结构中的岩藻糖可以提高 ADCC效应。如治疗性抗体CD20、Her2、EGFR等，去除或降低N-糖上核心岩藻糖后有更强的与FcγRIIIa的亲和力、更强的ADCC活性，并在动物体内或临床表现出更好的疗效。也有研究通过突变株表达岩藻糖敲除的 IgG 抗体，其与 FcγRIIIa 结合能力和ADCC效应更加明显的提高[2]。
03
去除岩藻糖修饰重要性
中国仓鼠卵巢CHO-K1宿主细胞已经广泛用于各种生物抗体药物开发，如治疗性蛋白的开发生产。CHO-K1细胞在生产复杂的治剂具有显著优势，如具有和人类IgG具有相似糖基化特征的抗体，包括细胞系特征、过程控制参数和细胞培养基成分在内的几个因素可能影响糖基化，因此可能影响生物活性、功效、稳定性、免疫原性、清除率、抗体依赖的细胞毒性（ADCC）。
然而，用野生型CHO细胞生产的抗肿瘤抗体药物的Fc部分的两个双天线复杂多糖链上都带有岩藻糖（Fucose）糖基，而岩藻糖基的存在会阻碍抗体和Fc受体之间的结合，进而影响该抗体的ADCC活力和抗癌效力。
尽管杂交瘤细胞YB2/0和植物细胞都可以作为CHO细胞生产抗体分子的替代品，但因不具备CHO细胞稳定和易放大性等优势，CHO细胞仍是生物制药企业的首要选择。
现阶段比较常用的减少/去除岩藻糖的方法有很多，如通过基因工程改造、酶法去糖、调控细胞的代谢途径或者化学修饰来实现。但寻找一种高效去除岩藻糖的方法，仍是迫在眉睫。
04
百英生物的平台优势
百英生物采用基因编辑技术敲除了自主改造的CHOK1BN细胞基因组内的岩藻糖基转移酶(Fut8)等位基因，Fut8能催化形成α-1,6岩藻糖苷键的岩藻糖基转移酶，敲除CHO细胞基因组内表达该酶的基因，细胞则无法正常对分泌抗体进行岩藻糖修饰，从而实现去除岩藻糖基化的目的。
图2 FUT8基因调控岩藻糖修饰
百英生物获得的无岩藻糖的宿主细胞CHOK1BN-Fut8KO，经过抗体表征及功能验证，可应用于工业生产。改造后的细胞系与未改造的CHOK1BN相比，生产的抗体，不仅实现了去除岩藻糖，而且抗体在表达量和质量等数据保持一致。
案例分享
（1）
糖型鉴定
对两种细胞分别进行糖型鉴定，结果显示，改造后的细胞未在N糖LC-MS中检测到岩藻糖修饰，说明CHOK1BN-Fut8KO cell可以成功表达去岩藻糖基化抗体。（C2193xxxx-1为普通CHOK1BN，C2193xxxx-2为CHOK1BN-Fut8KO）
图3 N糖LC-MS谱图
（2）
CHOK1BN-Fut8KO表达抗体纯度验证
CHOK1BN 和CHOK1BN-Fut8KO 表达抗体的纯度结果：高纯度，SDS-PAGE/SEC-HPLC验证抗体聚集和纯度，均符合>95%标准。
图4 SDS\SEC结果谱图
（3）
抗体ADCC活性
ADCC检测由无岩藻糖宿主细胞CHOK1BN-Fut8KO表达的抗体（Rituximab）和CHOK1BN表达的抗体（作为对照）对靶细胞的ADCC效应进行比较， 结果显示由CHOK1BN-Fut8KO表达的抗体相对于CHOK1BN的抗体介导的NK细胞对靶细胞的杀伤具有明显提高，其ADCC EC50值也显著提高（图5）。
图5 ADCC检测结果
（4）
抗体亲和力测定
利用Biacore检测抗体与抗原FcγRIIIa亲和力，结果显示，CHOK1BN-Fut8KO 表达的去岩藻糖基化抗体可显著增加与受体结合的亲和力，从而增强ADCC效应。
图6 Biacore亲和力检测结果
百英生物去岩藻糖CHOK1BN-Fut8KO细胞系的构建，免除后续工艺中去除岩藻糖的步骤，既降低了生产成本，又提高产品的均一性和纯度。百英生物将持续优化去岩藻糖抗体表达平台，保证以最优的品质和服务助力抗体药物的早期研究。
参考文献
[1]Nitin Agarwal etal., N-Glycosylation of IgG and IgG-Like Recombinant Therapeutic Proteins: Why Is It Important and How Can We Control It? ; Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 2020. 11:13.1-13.28.
[2] Shields RL et al.，Lack of Fucose on Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human FcγRIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. J. Biol. Chem. 2002; 277:26733-40.
百英生物 BIOINTRON
百英生物（Biointron）成立于2012年，是一家专注于抗体表达和抗体发现与优化CRO服务的国家高新技术企业、上海市科技小巨人培育企业、上海市专精特新企业。目前公司在上海周浦、江苏泰州设有研发和生产中心，在美国设有商务中心，以“抗体发现的加速器”为使命，致力成为全球抗体产业杰出的赋能者，提供一站式抗体发现服务。
